細(xì)胞傳代的操作步驟

細(xì)胞傳代是指去除原培養(yǎng)基，將細(xì)胞從原培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)移到新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，目的是使細(xì)胞得到進(jìn)一步增殖。依據(jù)細(xì)胞是否貼壁生長(zhǎng)，又分成貼壁細(xì)胞傳代和懸浮細(xì)胞傳代。下面分別介紹這2種生長(zhǎng)類型的細(xì)胞具體傳代步驟。

貼壁細(xì)胞傳代
貼壁細(xì)胞需要用到一種特定的試劑——蛋白酶，其作用是切斷細(xì)胞和容器之間，細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互粘連，用蛋白酶處理細(xì)胞的過程叫做“消化”，“消化”之后的下?lián)軙?huì)形成單細(xì)胞并從容器底部掉下來。常用的蛋白酶是胰蛋白酶。

材料準(zhǔn)備：

1、預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱；

2、用75%酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺(tái)和雙手；

3、正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且減少污染；

4、點(diǎn)燃酒精燈：注意火焰不能太小。

傳代流程：

1. 取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺(tái)內(nèi)。

2. 從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：注意培養(yǎng)瓶取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺(tái)面，再在鏡下觀察細(xì)胞。

3. 將培養(yǎng)瓶放入超凈工作臺(tái)后打開瓶口，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒。

4. 加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細(xì)胞較好好，消化溫度是37℃。

5. 顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度。

6. 棄去胰蛋白酶液，加入新鮮的培養(yǎng)液終止反應(yīng)。小心吹打成細(xì)胞懸液。

7. 將細(xì)胞懸液吸入10 ml離心管中。平衡后將離心管放入離心機(jī)中，以1000 rpm/min離心5 min。

8. 棄去上清液，加入適當(dāng)體積的培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。

9. 將細(xì)胞懸液吸出分裝至2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。

10. 顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要時(shí)計(jì)數(shù)。注意密度過小會(huì)影響傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5×105/ml。后要做好標(biāo)記。

11. 繼續(xù)培養(yǎng)：用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞2-4 h后開始貼附在瓶壁上。

2. 懸浮細(xì)胞傳代

由于細(xì)胞已經(jīng)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中懸浮，所以無需酶的作用使其從培養(yǎng)容器表面脫離，方法簡(jiǎn)單。通常有兩種方法。

材料準(zhǔn)備：

1、裝有懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)容器。

2、*生長(zhǎng)培養(yǎng)基，預(yù)熱至37℃

3、37℃培養(yǎng)箱，充有二氧化碳濃度為5%的濕化空氣。

傳代流程：

一、直接傳代法

① 待懸浮細(xì)胞長(zhǎng)滿至80%~90%（細(xì)胞懸液變黃），即可傳代；

② 用吸管吸棄細(xì)胞懸液1/2~1/3；

③ 加入適量的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

二、離心傳代法（在發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞碎片的情況下）

① 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)；

② 150g離心5min，棄去上層清液；

③ 使用新鮮的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；

④ 吸管吸取適量細(xì)胞懸液，裝入新的培養(yǎng)瓶，再加入適量的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。